作者：陳偉挺醫師
使用 aspergillus PCR 來診斷 invasive aspergillosis，一直存在著 PCR 缺乏標準化的老問題，而且如何判讀 aspergillus PCR 為陽性（到底是 single positive 或是 multiple positive 叫做 positive），也是有待討論與共識。
關於 aspergillus PCR 標準化，EAPCRI 主要著重在三大方向，包含 sample type 的選擇（以及 volume）、如何進行 DNA extraction，以及相關 PCR protocol 的制訂。
其中關於 sample type 的選擇，在近幾年的研究中，則是有一些進展。主要著重在三種 sample type：serum、plasma、whole blood 的比較。
首先來比 serum 和 plasma。
White 等人的 retrospective case-control study（hematology patients） 顯示，不管是在 sensitivity 或 specificity 方面，plasma 的表現，均較 serum 要來的良好。
而且在提早診斷 invasive aspergillosis 方面，plasma 可以比現有臨床診斷，提早 16.8 天的時間呈現陽性，比起 serum 的 10.8 天，也是有較佳的表現。
再來比 serum 和 whole blood。
同樣是 White 的研究團隊，針對 animal model 進行 serum 和 whole blood 的檢體比較，可以發現不管是在 sensitivity 或 specificity 方面，whole blood 的表現，均較 serum 要來的良好。
接下來三種檢體（serum、plasma、whole blood）都來比一比，我們來看看 Springer 等人的另一個小型 retrospective case-control study。
首先看 single and multiple positive 的 sensitivity 結果。
由上圖可知，plasma 的檢體類別，不管是在 single or multiple positive 的 sensitivity 方面均表現最佳，具備作為一個良好 screening tool 的條件。
接下來看 single and multiple positive 的 specificity 結果。
由上圖可知，whole blood 的檢體類別，不管是在 single or multiple positive 的 specificity 方面均表現最佳，均為 96%。
但可以注意到的是，serum/plasma 的檢體，在進行 multiple 檢測之後，其 specificity 亦可大幅提高至與 whole blood 檢體 comparable 的程度。
特別是 plasma 檢體，在 multiple testing 的條件下，其 sensitivity 約僅減損 9%（91% 降至 82%），但 specificity 卻可從 53%，大幅提高至 92%。
此研究也發現，（1）連續多次檢測的 plasma PCR，和（2）同時檢測多種檢體的 PCR（如同時檢測 serum + plasma + whole blood），其實有類似的 performance。
所以如果想要簡單一點的話，可以考慮選擇 plasma 的檢體類別，進行連續多次的檢測，或是想要追求時效的話（縮短 time-to-diagnosis），也許同時檢測 serum + plasma + whole blood，也是另一種思維方式。
而在 Springer 等人的研究中也發現，使用 plasma 檢體的 PCR cycle 數（Cq，quantification cycle），在 positive case 和 control 之間也有統計上的差異，但在 serum 或 whole blood 的檢體中，則無這樣的現象。
上面則表列一些常見的 commercial kit for aspergillus PCR，提供大家參考。而 commercial kit 的使用，也有助於一部分的標準化推行。
Summary
Aspergillus PCR 的檢測，基本原理是偵測（1）cell free DNA（circulating free DNA），以 serum/plasma 檢體為主，或是偵測（2）cell-associated DNA，則以 whole blood 檢體為主。
而又因為 blood clot formation 會將 aspergillus 的 biomarker 從 serum 中移除，進一步減損 circulating free DNA，因此 plasma 相較於 serum，由現有研究證據顯示，是一個較好的檢體選擇。
而且目前其它的 non-culture-based diagnostics，如 galactomannan antigen 和 beta-D-glucan 等，亦可使用 serum/plasma 檢體進行檢測，使用 serum/plasma 檢體，可以達到一魚多吃的好處。（一次檢驗 galactomannan antigen + beta-D-glucan + PCR）
而 whole blood 的檢體，則是因為檢體操作需要多費功夫（需要 lyse red/white cells），一方面在 DNA extraction 上，也較無 commercial kit 可供使用（目前的 commercial kit for DNA extraction 多針對 serum/plasma 檢體），因此目前是一個較 labor-intensive、較不容易標準化的檢體類別。
Springer 等人的研究中，其 whole blood 的表現遠不如過去文獻亮眼的原因，作者則是推論，可能和（1）檢體儲存較久，造成 fungal cell lyse，aspergillus biomarker 釋放成為 cell free DNA，以及（2）whole blood 的檢體在檢測之前，就有 1ml 的 plasma 先被取走進行檢測的緣故。
